怎样高性价比地鉴定菌群到“种” | 微生物专题

开展细菌群落研究，首先要鉴定出样本中有哪些细菌，才能进行细菌与疾病之间的相关性讨论，乃至更深入的细菌与疾病之间的因果性证明。怎样才算是把细菌鉴定出来了？从分类学讲，种（species）是细菌分类的基本单位。那么将细菌精细地鉴定到种才算是。将细菌鉴定到种，不仅是分类学的要求，也是微生物组研究的要求（为什么说菌群鉴定到”种”很重要）

我们知道，细菌鉴定首选16S rDNA序列。采用16S序列可以将细菌注释到种水平。然而，现实情况是，受二代测序短读长的限制，常规16S rDNA测序只能妥协于对16S的部分可变区（如V3-V4）进行测定，这个长度仅占全长16S序列（约1.5 Kb）的30%左右，使得菌群鉴定的分辨率和准确性都打了折扣。使用常规16S测序，只能准确获取属水平的菌群分类鉴定结果，而丢失了大部分更重要的种水平的信息！

还有其他方法使用16测序鉴定菌群到种吗？

有的！

既然二代测序读长不够，那我们就采用具有超长测序读长的三代测序仪PacBio来进行全长16S测序，进而实现“种”水平的菌群多样性分析（图1）。此外，使用宏基因组测序也可以鉴定菌群到种，但是实验支出会高出一大截，不适合做大量样本的菌群筛选。全长16S测序是更具性价比的菌群鉴定到种的工具。

图1 PacBio超长读长测序原理

直接测得全长16S序列

借助新款PacBio仪器超长测序读长，平均测序读长约15 Kb，最长可达25 Kb，平均可达16S序列长度（约1.5 Kb）的10倍，因此我们可以轻而易举地测序得到完整的全长16S序列（囊括全部9个可变区V1-V9），并且序列准确性超过二代测序（图2）。

图2 PacBio全长16S测序囊括全部9个可变区V1-V9

种水平注释率提升10倍

Johnson等使用计算机模拟评估不同可变区进行种水平菌群准确分类的能力，发现不同的可变区对种水平的分类能力存在较大偏差且有偏好性，全长16S（V1-V9）可实现几乎所有的序列注释到物种上（图3）[1]。

根据项目数据，全长16S测序的种水平平均注释率≥ 60%，约是常规16S测序的种水平注释率的10倍，并且消除了使用部分可变区进行注释的物种偏好性。不仅如此，其他分类水平上注释到菌群数量也有增加，可以帮助研究人员获取更完整地菌群结构信息。

图3 以不同可变区进行模拟测序构建进化树

图中颜色越红代表不能鉴定到种的比例越高。

加速微生物组的临床转化

全长16S测序加速助力微生物组研究取得新的非凡科学发现。种水平的菌群鉴定代表着更特异地鉴定出疾病的菌群标志物，更精准地筛选药物作用的细菌靶点，为后期机制验证和临床转化提供详实可靠的数据。

案例一：完整的肠道菌群可有效降低遗传易感个体白血病发病风险（IF：22.113）[2]

 尽管有1-5%的儿童为前体B细胞急性淋巴细胞白血病（pB-ALLs）遗传易感性，但不到1%的风险基因携带者最终会发展为pB-ALLs。本研究发现，在pB-ALL小鼠模型中，抗生素处理导致的肠道菌群失调可在无感染性刺激源的情况下，诱导白血病发生。使用16S V4和全长 16S测序分析一系列粪便菌群，发现pB-ALL的遗传易感性会塑造独特的肠道菌群。进一步地研究表明，共生菌群紊乱（而非特定细菌感染）促进了遗传易感性个体的白血病发生（图4）。

图4 共生菌群紊乱促进了遗传易感性个体的白血病发生

案例二：相比于母亲粪便和阴道菌群，胎粪菌群与羊水菌群具有更多的共同特征（IF：10.245）[3]

婴儿肠道菌群哪里来？为精细地探讨婴儿肠道菌群的起源特征，本研究使用全长16S测序分析了 39 对母婴配对的母体样本（羊水、粪便、阴道分泌物、唾液）和婴儿胎粪，共5组192份样本的菌群。研究结果表明，胎粪菌群来自多个母体部位的播种，在所调查的母体部位中，羊水菌群对胎粪菌群播种的贡献最大（图5）。

 图5 不同分类水平下5种类型样本的菌群组成

IF：胎粪；AF：羊水；MF：母粪；MS：母唾液；MV：阴道分泌物。门水平（a，b）；属水平（c，d）；种水平（e，f）。 

全长16S测序项目参数

参考文献

1. Johnson JS, et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nat Commun. 2019 Nov 6;10(1):5029.

2. Vicente-Dueñas C, et al. An intact gut microbiome protects genetically predisposed mice against leukemia. Blood. 2020 Oct 29;136(18):2003-2017.

3. He Q, et al. The meconium microbiota shares more features with the amniotic fluid microbiota than the maternal fecal and vaginal microbiota. Gut Microbes. 2020 Nov 9;12(1):1794266.

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